TUNEL法检测细胞凋亡实验

　　想要做好TUNEL实验，首先要选择好用的TUNEL试剂盒外，选择对了试剂盒就成功了一半了，市面常用的TUNEL试剂盒有Vazyme公司和Roche公司的。

　　有些童鞋在TUNEL法检测细胞凋亡实验中，问题五花八门，结果就一个做不出来，小博呕血把自己的经验总结出来供大家参考，影响TUNEL实验成败的关键因子有以下：

　　1. 样品准备，高质量的切片

　　?悬浮细胞：可以按照细胞悬液的TUNEL检测方式操作，上流式细胞仪检测结果，需要起始细胞量不低于3–5×106个细胞。

　　?贴壁细胞：制作细胞爬片，用作爬片的玻片最好用多聚赖氨酸处理

　　，防止脱片。

　　?细胞涂片：制备密度为5×107cells/ml的细胞悬液，取100μl涂片。用来制作涂片的玻片最要用多聚赖氨酸处理，建议细胞样品以细胞爬片或涂片的方式进行检测。

　　2. 假阳性

　　假阳性--固定不充分

　　?固定不充分：包括石蜡切片制作前组织的固定和冰冻切片回温后的固定

　　?固定液浓度过高会导致组织边缘迅速固定，影响固定液的穿透，导致组织中心固定不佳，DNA仍会在核酸内切酶的作用下断裂，造成假阳性。

　　?组织或切片过厚也会影响固定效果。

　　假阳性--基因转录水平高

　　?基因转录活性高的非凋亡细胞会产生假阳性

　　?例如睾丸组织：正常的组织切片也能标记上荧光

　　Source: Toxicologic Pathology, 40: 667-674, 2012

　　假阳性--激发光下长时间照射

　　PI染色后紫外光照射0min PI染色后紫外光照射8min

　　在强激发光长时间照射下，高浓度的PI会吸收能量，在488nm的激发光照射下发出绿色荧光，产生假阳性，建议选择DAPI染核,如果用PI染核选择1-2μg/ml的低浓度并充分洗涤。

　　3. 非特异性

　　非特异性--过曝

　　曝光100ms 曝光3s

　　拍照条件的选择很重要，背景越干净越好，最好是根据阴性对照和阳性对照来选择，最佳的拍照条件是保证阴性对照背景干净，同时阳性对照荧光清晰明亮。

　　非特异性—操作过程中干片

　　如果操作过程片子干掉不但会有非特异性染色，而且整个组织都会被破坏，导致细胞形态无法分辨。洗涤过程最容易发生干片，片子从PBS里取出后只需擦去组织周边多余液体，一定要让组织保持湿润，特别是一次处理较多样本时最易干片。

　　非特异性—多聚甲醛过期

　　多聚甲醛在4度的保质期只有两周，一旦过期，固定效果就会变差，在后续操作中细胞形态会发生变化甚至自溶，表现为细胞碎裂，看不到完整的细胞核，荧光星星点点，变的碎小，分布于整个组织。多聚甲醛最好现用现配。

　　非特异性染色—洗涤不充分

　　?固定，通透等步骤中的试剂有自发荧光，如果洗不干净会产生非特异性染色；

　　?未标记的荧光物质如果不洗掉也会产生非特异性染色。

　　?如何洗干净：

　　ü洗涤方式，建议轻摇震荡洗涤；

　　ü增加洗涤次数，15min/2次变为5min/4次；

　　ü在PBS里加入0.1%的TritonX-100或5mg/ml的BSA，可减少非特异性染色，使背景干净

　　4. 假阴性--通透不彻底

　　?ProteinaseK 20μg/ml 5-10min

　　?通透原则：

　　ü切片越厚通透时间越长，最好切片厚度小于10um，既容易通透，脱片的风险也会降低；

　　ü石蜡切片通透时间比冰冻切片长；

　　ü细胞较松散的组织如肺泡组织用较短的通透时间即可，但细胞致密的组织如心肌组织，通透时间和ProteinaseK浓度都应适当增加，必要时可提高反应温度，由室温提高到37度。

　　假阴性--标记不充分

　　?盖玻片使用不当：不应使用玻璃盖玻片

　　?反应时间不够：可延长至2小时

　　?反应温度不当：确保在37度反应

　　5. 设置对照的重要性

　　?阳性对照：通透后，加入100μl含5.5–10 units/ml DNA酶I的缓冲液，室温孵育10分钟，使样本DNA人为地产生断裂，标记产生阳性反应。

　　意义：可以排除实验方法和操作有无问题

　　?阴性对照：在标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同，样本无法标记上dUTP 而无颜色反应

　　意义：排除凋亡外的非特异性染色