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生物探索
编者按
8月3日，《自然-生物技术》发布声明：撤回韩春雨团队于2016年5月2日发表在该期刊的论文。而韩春雨团队表示：会继续调查该研究缺乏可重复性的原因，以提供一个优化的实验方案。在发表韩春雨等人撤稿说明的同时，该期刊发表了一篇社论指出：是时候该用数据说话了！
北京时间8月3日，《自然-生物技术》（Nature Biotechnology ）发布声明称，撤回韩春雨团队于2016年5月2日发表在该期刊的论文“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”。据悉，论文是韩春雨主动申请撤回。
此前，原论文一发表，韩春雨团队及其报告的NgAgo技术得到了诸多喝彩声。论文中所描述的NgAgo技术是利用格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute核酸内切酶，以DNA为介导进行基因编辑，简称NgAgo-gDNA。在论文中，韩春雨团队使用NgAgo-gDNA技术，在哺乳动物细胞基因组上的47个位点进行了100%的基因编辑，效率为21.3%~41.3%。按照韩春雨团队的实验结果，该技术效率之高，能媲美已有“基因魔剪”之称的CRISPR-Cas9，对基因的特定位点进行准确地剔除、添入等。
1韩春雨撤稿声明：会继续调查该研究缺乏可重复性的原因，以提供一个优化的实验方案
在原论文的最后，《自然-生物技术》附上了韩春雨等人的撤稿声明。他们表示：“由于科研界一直无法根据我们论文提供的实验方案重复出论文图4所示的关键结果，我们决定撤回这项研究。在该图中，我们报告说，利用5′磷酸化单链DNA作为引导，NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）能够有效引起双链断裂，并对人体细胞基因组进行编辑。虽然许多实验室都进行了努力（Protein Cell 7,913-915, 2016; Nat. Biotechnol.35, 17-18, 2017; Cell Res.26, 1349-1352, 2016;PLOS One 12, e0177444, 2017) ，但是没有独立重复出这些结果的报告。因此，我们现在撤回我们的最初报告，以维护科学记录的完整性。不过，我们会继续调查该研究缺乏可重复性的原因，以提供一个优化的实验方案”。
2《自然-生物技术》社论：是时候该用数据说话了！
一项宣称通过Argonaute酶实现基因编辑的研究被撤回，这显示了论文发表后的同行评议在全天候媒体（24/7）时代的重要性。
本期，韩春雨及同事撤回了发表于去年5月的一篇论文。该论文称，短5′磷酸化单链DNA（short 5′ phosphorylated single-stranded DNAs）可引导格氏嗜盐碱杆菌核酸内切酶（Natronobacterium gregoryi Argonaute，简称NgAgo）产生双链断裂，实现对人类基因组的编辑（详见：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute）。论文一发表，便引起科研人员的极大兴趣和媒体的竞相报道。但是很快，在Twitter、博客和其它社交媒体的助燃之下，有关该研究可重复性的质疑开始迅速增多。去年11月，本刊发表了“编辑部关注”（Editorial Expression of Concern），提醒科研界留意这些可重复性方面的担忧。为了最终解决这个争议，多个研究小组在几个月里生成了更多的实验数据。如今尘埃落定，这也是世界各地的许多实验室为澄清NgAgo的功能而付出的大量时间、精力和资金的证明。
韩春雨的这篇论文自去年发表后所产生的影响力，再怎么夸张地说也不为过，尤其是在论文的来源地中国。中国媒体纷纷进行报道，以大标题宣告一项全新基因编辑系统的发现。这无疑是一篇中国去年被报道最多的论文；媒体监测公司融文咨询（Meltwater）的数据显示，仅在论文发表后的最初两个月里，就有将近4000篇相关的中文新闻报道。
NgAgo的轰动之处集中在它有可能补充，甚至取代CRISPR/Cas9基因编辑系统之一点上。NgAgo有望以一个目标序列进行基因编辑（Cas9不仅需要目标序列，还需要另外一个附近的识别（PAM）序列）。而且，初始数据还显示了它在其它方面的优势，如引物的稳定性更强（DNA相对于Cas9采用的RNA），增强特异性，减少基因组编辑脱靶，改善在基因组富含GC区域的活性，以及使所用的试剂更易于合成和处理。
如果说这一切都听上去太过美好而令人难以置信，那么去年夏天以来，随着越来越多的实验室无法重复该论文所报告的基因组编辑功能，质疑声便开始出现了。在各种基因组编辑会议上，在新闻讨论组和电子邮件中，这篇论文成为最热话题之一。这很快便引起媒体注意，有关该初始报告有效性的正反两方面的声音开始交锋。我们内部的图像完整性筛查没有发现韩春雨论文的明显异常，复查数据的三位外部评审人也持相同观点。
在此期间，《自然-生物技术》一直与科研界保持联络，关注各种为重复论文所做的持续努力。最终，在编辑们的协调下，三个独立小组的成果形成了一篇单独的反驳性论文，并通过了同行评议（Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute，见Nat. Biotechnol.34, 768–773, 2016）。有了这些数据，我们就有充分的理由去提醒读者留意该论文可能存在问题，我们将正式的“编辑部关注”发表在该篇论文所在的网址上，此举得到包括韩春雨在内的两位论文作者的支持。
我们也询问了论文作者是否可以解答科研界为何难以重复他们的结果。于是，去年12月，韩春雨及同事，还有另外几个与本刊联系的独立研究小组，提供了新的数据，称已经重复了NgAgo基因编辑活性。当时，本刊编辑和一位外部评审人都判定这些数据太过初级，不满足发表标准。因此，我们决定给这些原始论文作者和新的研究小组更多时间来收集更多的能支持其论点的实验证据。
现在，距原论文发表已过去了一年多，我们了解到当初曾报告说初步成功重复出实验结果的独立研究小组，无法强化初始数据，使其达到可发表的水平。类似的，在征求专家评审人的反馈意见后，我们判定韩春雨及同事提供的最新数据不足以反驳大量与其初始发现相悖的证据。我们现在确信韩春雨的撤稿决定是维护已发表科研记录完整性的最好做法。
这篇有关NgAgo的论文发表出来，并不是科研过程的结束，而是开始。与任何其它发表出来的报告一样，正是广大的科研共同体对相关方法进行了检验，识别潜在的错误来源，验证试剂并优化试验。在本例中，有多位敬业的研究者个人对已发表实验方法的各种细节进行检验，并完成记录翔实和有对照组的反驳性研究 （Questions about NgAgo，见Protein Cell 7, 913, 2016；NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish，见Cell Res. 26, 1349–1352, 2016；No evidence of genome editing activity from Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) in human cells，见PLoS One, 12, e0177444, 2017）。
这篇NgAgo论文也显示了社交媒体的利与弊。显然，这些平台对于迅速提醒广大科学界留意该论文可能存在的问题发挥了重要作用。但是，它们也抬高了人们的预期，以为有关这篇论文的问题是直截了当，可以快速解决的。然而，关于NgAgo的各种问题是无法在几个星期或几个月内就能澄清的，这是有原因的。即使是简单的实验也需要花费数周来准备、实施、分析和解决出现的问题。另外于事无益的是，那些进行可重复性研究的人，其付出的努力往往得不到回报——这样的工作单调乏味，没有资金支持，还吃力不讨好。
难怪在希望得到快速、明确答案的全天候媒体和公众眼中，论文发表后的同行评议流程似乎慢得让人沮丧。但是，当涉及生物学时，往往没有明确的答案。当研究重复性时，有一点我们是知道的，那就是这需要花时间来做。就这篇有关NgAgo的论文而言，现在是时候了，数据已经说话了。
3NgAgo论文事情始末回顾
2016年5月2日
河北科技大学副教授韩春雨课题组在国际顶级期刊《自然-生物技术》上发表了NgAgo基因编辑技术的论文，描述NgAgo（格氏嗜盐碱杆菌的核酸内切酶）编辑基因有效，而且与Cas9-sgRNA在切割哺乳动物基因组DYRK1A位点的效率上可以媲美。
7月21日
中科院神经所研究员仇子龙发表声明，称能在基因组水平看到NgAgo引起的基因编辑，并呼吁韩春雨尽快发布NgAgo 2.0版和Smart版。这是韩春雨之外迄今唯一实名宣布加入NgAgo和ssDNA后可以看到基因编辑的研究组。
7月29日
澳大利亚国立大学GaetanBurgio教授发表长文表示无法重复韩春雨团队的实验结果。随后，美国、西班牙等多位科学家也表示，无法重复韩春雨NgA系统的基因组编辑结果。
8月8日
《自然》杂志网站发表一篇报道，详细记述了多国科学家对于韩春雨的NgAgo的争论。文章指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示实验不可重复。
10月10日
12位学者站了出来，决定实名公开他们“重复”韩春雨实验方法的结果：“阴性的”、“不工作”等等。这样结论的通俗表达即是，他们没能“重复”出韩春雨的实验，其实验方法“让人怀疑”。
10月12日
北京大学饶毅教授及中科院院士邵峰通过《知识分子》联合发文，公开与河北科技大学校长的信件，他们在信中建议各方包括河北科技大学谨慎对待韩春雨及其研究成果。
10月14日
河北科技大学就韩春雨实验结果受质疑作出书面回应称：已有机构用韩春雨团队技术实现基因编辑，具体信息会适时向社会公布。
11月15日
由国内外二十家实验室负责人联名撰写的一篇名为“Questions about NgAgo”的学术论文在Protein Cell杂志上发表（Burgess et al., 2016），首次公开以公开发表学术论文的形式提出无法重复韩春雨的NgAgo实验。
11月29日
《自然-生物技术》发布最新声明，就此前发表的韩春雨等所著论文《利用NgAgo进行DNA引导的基因编辑》发表了“编辑部关切”，并发表Toni Cathomen及同事的通信文章，或将否定韩春雨原论文所称的有效编辑内源性基因的这一主要发现。
2017年1月9日
国家知识产权局发布 “视为撤回通知书”。显示以河北科技大学副教授韩春雨、浙江大学基础医学院研究员沈啸为发明人的专利——以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术，因申请人未在规定期限内答复国家知识产权局的第一次审查意见通知书，该专利的申请被视为撤回。
1月19日
《自然-生物技术》发布声明指出，该期刊已获得有关韩处于实验可重复性的新数据，需要调查研究这些数据。
1月19日
河北科技大学官网贴出了“河北科技大学基因编辑技术研究中心与诺维信公司签署合作协议”的文章。次日，诺维信公司发表声明承认在NgAgo上达成合作。但河北科技大学和诺维信公司都在重复性问题上避而不提，只是分别表示NgAgo在“真菌表达系统”和“生产酶的微生物表达系统”上有潜力。
5月9日
《自然-生物技术》在线发布了一则“编辑部关切”。内容显示：NBT的编辑注意到了读者们对韩春雨2016年5月2日在线发表的有关NgAgo论文重复性的担忧。
8月3日
论文正式撤稿。
4不能基因编辑的NgAgo，究竟能干嘛？
尽管韩春雨等人表示会继续调查该研究缺乏可重复性的原因，以提供一个优化的实验方案，但这一撤稿无疑是对NgAgo具有基因编辑功能最大的否定。那么，不能发挥基因编辑作用的NgAgo究竟有什么作用呢？
在韩春雨团队关于NgAgo的首篇Nature Biotechnology发表之后，一些关于NgAgo其它功能的论文也得到了很大的关注。
抑制乙肝病毒复制
上个月，发表在Antiviral Research杂志上题为“NgAgo-gDNA system efficiently suppresses hepatitis B virus replication through accelerating decay of pregenomic RNA”的论文中，来自山东大学等机构的研究人员证实，NgAgo-gDNA系统能够通过促进pgRNA（pregenomic RNA）的降解有效抑制乙肝病毒的复制。
该研究在结论中称，这一研究结果首次证明了NgAgo/gDNA在抑制乙肝病毒复制方面的潜力。研究发现，抑制效果明显与gDNA靶向区域（gDNA targeting region）有关。此外，尽管HBsAg（hepatitis B surface antigen，乙肝表面抗原）、HBeAg（hepatitis B e-antigen，乙型肝炎E抗原）和pgRNA的水平明显下降，但作者们未能检测到NgAgo的任何DNA编辑能力。最后，作者们证明，NgAgo/gDNA显著缩短了乙肝病毒pgRNA的半衰期。他们认为，这些结果为将NgAgo/gDNA系统用于控制病毒感染提供有趣的线索。
切割RNA
今年1月，在生命科学预印本网站BioRxiv上，来自韩国的一个研究小组发表的题为“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的成果指出，NgAgo能作为一种DNA引导的核酸内切酶切割RNA，而不是DNA。这意味着NgAgo或许可以作为“RNA干扰”的一种工具发挥作用。
基因敲低
去年11月，发表在Cell Research 杂志上题为“ NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文中，南通大学神经再生重点实验室副教授刘东团队观察到，NgAgo 确实可以改变斑马鱼的表型，但这并非是通过基因编辑实现的。团队通过实验得出结论，NgAgo 系统可以在不改变目标基因序列的情况下，对基因表达实现 knockdown（即下调其目标 mRNA 表达水平），且这可能与 NgAgo 的基因剪切活性没有关系。
备注：本文部分内容参考自澎湃新闻等。
End
参考资料：1）Time for the data to speak
2）DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute
3）Questions about NgAgo
4）NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish
5）No evidence of genome editing activity from Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) in human cells