CRISPR进化史—从基因编辑到基因检测

这些发现带来了CRISPR-Cas9系统的巨大变革。它让科学家们能够完成先前不敢设想的工作。如今，我们有望能清除每一个受感染细胞中的艾滋病病毒，或是治疗镰刀状红细胞贫血症等经典的遗传疾病。甚至，科学家们已经畅想利用它来攻克癌症的可能。此外，它也能在植物的基因组中得到应用。这能带来全新的生物能源，或带来性状更稳定的作物。

CRISPR基因编辑技术开启五大“门派”

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打破剪切

CRISPR-Cas9技术有两个主要成分：一个是Cas9酶，可以像一把分子剪刀一样剪切DNA；另一个是小RNA分子，将“剪刀”引向具体的DNA序列并进行剪切。细胞的固有DNA修复机器通常会修复剪切，但是经常会发生错误。

尽管如此，这已经给希望扰乱基因以了解其工作内容的科学家带来了福利。基因编码是无情的：修复中间发生的一个小小错误都会完全改变其编码的蛋白序列，或是完全停止蛋白生产。因此，科学家可以在蛋白或基因扰乱时，研究细胞或有机体发生了什么。

但是还有一种不同的修复通道，有时也会根据DNA模板修复剪切。如果研究人员有了模板，那么他们就能够在选择的几乎任何位点编辑几乎任何想要的基因序列。

加州大学旧金山分校系统生物学家Jonathan Weissman团队希望了解这种基因编辑工具在剪切人类DNA方面究竟表现如何，但他们打算采用一种不同的方法。“我们做的第一件事是：打破剪切。”Weissman说。该团队用“死”Cas9尝试了一些新方法。研究人员将其系在另一个蛋白的一部分上，该蛋白能够激活基因表达。加了几个其他扭曲，他们最终让基因可以根据意愿打开及关闭。

此后，若干实验室基于该方法发表了不同的研究成果。该方法也吸引了麻省理工学院合成生物学家Ron Weiss加入CRISPR的研究热潮。该团队在一次实验中建立了多个基因扭曲，使其可以更快、更简便地构建复杂的生物学回路。“合成生物学最重要的目标是能够通过这些精确的回路构建复杂的行为。”Weiss说。

2

表观遗传

当遗传学家Marianne Rots开始其职业生涯时，她希望发现新的医疗方法，通过基因疗法靶向那些疾病变异基因。几年后，在荷兰格罗宁根大学医学中心工作的她决定改变行动方向。她认为，控制基因活动的最佳方法是调整表观基因组，而不是基因组本身。

表观基因组是附加在DNA及DNA包裹蛋白化合物（即组蛋白）上的集合体。它们能够控制DNA通路，打开或是关闭通向基因表达的蛋白。而这些标记会随时间改变：随着有机体发育及环境变化，它们会被添加或去除。

过去几年，数百万美元已被投入到这一领域，如计算不同人体细胞中的表观遗传标记以及与大脑活动和肿瘤生长相关联的遗传模式。但是由于没有能力改变具体位点的标记，研究人员就不能决定它们是否会导致生物学变化。

CRISPR-Cas9将会扭转局势。2015年4月，北卡罗莱纳州生物工程师Charles Gersbach和同事发表了一项技术，利用剪切将乙酰基（一种表观遗传标记）添加到组蛋白上。

Rots曾利用相对较老的基因编辑工具锌指酶蛋白探索表观遗传标记的功能，现在她在利用CRISPR-Cas9。“新工具让这一领域变得民主化，而且已经产生了广泛影响。”她说。Rots表示，人们以前经常说，如果重新编写表观遗传基因，并不会对基因表达造成影响，或者两者之间的关系是巧合。“但是现在测试起来非常简单，很多人都在加入这一领域。”她说。

3

代码解密

DNA表观遗传标记并非唯一等待解开的基因代码。超过98%的人类基因组均未指明蛋白质遗传密码。研究人员认为，大量的DNA发挥着重要作用，所以他们正在利用CRISPR-Cas9了解代码是什么。

RNA分子的一些编码，如小分子RNA和小分子核糖核酸和长非编码RNA，被认为与生产蛋白没有关系，其他序列是在其指令下扩大基因表达的“增强子”。大多数与常见疾病风险相关的DNA序列位于包含非编码RNA及增强子的基因组区域。但是在CRISPR技术之前，研究人员很难了解那些序列在做什么。“我们没有好方法在功能上解释非编码基因组。”Bauer说，“现在，我们的实验精巧多了。”

随着研究人员利用CRISPR-Cas9技术探索越来越多的常规DNA，可能还会出现更多惊喜。然而，即便是利用CRISPR-Cas9，探索这一未知领域也存在挑战。Cas9酶能在RNA向导的指引下剪切需要编辑的地方，但这只能是当一种具体、常见的DNA序列位于剪切点附近时。这会给那些希望让某个基因沉默的科学家带来一点难题，因为关键的序列几乎永远存在于该基因内部。研究人员正在探索细菌王国，寻找能够识别不同序列的Cas9酶的“亲族”。

去年，麻省理工学院和哈佛大学下属博德研究院Feng Zhang实验室发现，一个叫作Cpf1的酶的家族能够扩展序列选择。但是Agami强调，到目前为止所发现的像Cas9一样用途广泛的酶仍然非常少。未来，他希望能够拥有整个系列的、可用于靶向基因组中任何位点的酶。“我们现在还没有到达那里。”他说。

4

接触光线

Gersbach实验室正在利用基因编辑技术作为理解细胞命运以及如何操纵细胞的部分工具：该团队希望未来有一天能够在培养皿中培育出组织，用于药物检测和细胞疗法。但是CRISPR-Cas9的作用是永久的，Gersbach团队需要不时地打开或关闭基因，并且要在组织中非常具体的位点进行。“模拟血管需要高度的控制力。”他说。

Gersbach和同事选择了不规则的编辑“剪刀”——现在能够激活基因的Cas9，并加入了通过蓝光激活的蛋白。当细胞接触光线后，该系统能够激发基因表达；但没有光后，系统会停止基因表达。由日本东京大学生化学家Moritoshi Sato带领的团队研发了类似的系统，并且也可以在接触到蓝光后激活Cas9，实现基因编辑。

通过将CRISPR技术与化学“开关”相结合，其他人也得到了类似的结果。纽约威尔康乃尔医学院癌症遗传学家Lukas Dow希望在成年大鼠体内产生与癌症变异相关的基因，从而复制出在人类结肠直肠癌患者中发现的基因突变。该团队利用CRISPR-Cas9技术，通过一个剂量的脱氧土霉素激活Cas9，从而使其切断靶向目标。

5

疾病模型

从癌症到神经退行性疾病等领域的研究人员正在通过CRISPR-Cas9技术创建疾病动物模型。这让研究人员对更多动物、以更复杂的方式、在更大的范围内进行基因编辑。马萨诸塞大学医学院癌症研究专家Wen Xue正在系统地选择肿瘤基因数据，利用CRISPR-Cas9模拟培养皿以及动物体内细胞生长过程中的突变。

研究人员希望通过混合匹配新的CRISPR-Cas9工具，精确操纵动物模型的基因组和表观基因组。“真正的力量是整合那些系统。”Dow说。这可能会让科学家获悉及理解常见疾病的复杂特征。

生物工程师Patrick Hsu在2015年建立其位于加州萨克生物研究所的实验室，旨在利用基因编辑技术在培养皿以及绒猴身上模拟神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症。那样将能够比大鼠模型更有效地重现人体疾病，但是在没有CRISPR-Cas9之前，实现这一切成本极其高昂，且过程极为缓慢。

即便在他设计的实验进行首个CRISPR-Cas9狨猴基因编辑时，Hsu也很清楚，这种方法只是下一种技术的“踏脚石”。“科学技术旧的去了，新的又来了。你不能永远和一种技术‘谈恋爱’。”他说，“你应该永远在思考，什么样的生物学问题尚待解决。”

人体基因治疗应用

基因编辑“能将物种DNA换成我们想要的”,依靠它,人类不仅可以实现动物、植物的快速定向育种,而且能推动疾病治疗的颠覆性革命,获得“改写生命剧本的神笔”。不远的未来,人类有望将无法治愈的疾病变成能长期控制的慢性病

美国仍在研究，如何将 CRIPSR 基因编辑技术应用于人体。与此同时，中国正在这个领域快速行动，试图取得突破。

根据 《华尔街日报》的报道 ，自 2015 年以来，中国国内已经用 CRISPR-Cas9 技术，在 86 人身上进行了基因编辑试验。与美国不同，中国没有相关的规则和规定，避免科学实验走向错误的方向。因此，杭州市肿瘤医院院长吴式琇一直在尝试使用这项技术去治疗癌症病人。

实际上，医院的管理者只在一天下午，花半个小时就批准了吴式琇的计划。

目前尚不清楚，这些尝试是否取得了效果。不过初步报告显示，有些试验取得了成功。然而，这并不是中国首次在人类身上使用 CRIPSR 技术，而这样的尝试往往产生灾难性后果。2016 年，中国科学家曾试图用 CRIPSR 技术对人类胚胎进行基因改造，但发现至少有 2/3 发生了基因突变，在 28 个存活胚胎中只有一小部分（总共有 86 个）包含了替代的基因信息。

根据美国 国家医学数据库 的信息，中国已开展了至少 9 项基于人体的 CRISPR 试验。《华尔街日报》还发现，自 2015 年以来，中国对这项技术还进行了至少两次人体试验。

▲黄军就教授在做实验。

2016年8月,四川大学华西医院肿瘤中心胸部肿瘤科主任卢铀团队将开展全球首个CRISPR-Cas9基因编辑治疗肺癌的临床试验。英国《自然》杂志对其评价为“领先于世界其他正在进行的基因编辑试验”。

尽管有些人担心，中国会借此在 CRISPR 技术方面取得优势，但也有人呼吁，对这种新技术保持谨慎和耐心。CRISPR 技术最初由珍妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和艾玛纽尔·查彭提尔（Emmanuelle Charpentier）共同发现。美国和欧洲都对此持保守态度，尚未启动人体试验。

宾西瓦尼亚大学 CRISPR 研究团队首席科学家卡尔·朱恩（Carl June）博士表示：“很难判断，如何在快速行动和确保患者安全之间保持平衡。”在解决多方面的监管障碍之后，该团队也将启动人体试验。

应用于基因检测

2月15日的《Science》上发表的两项研究分别展示了由 Jennifer Doudna 和张锋实验室基于 CRISPR 系统开发的全新诊断工具。

在其中一篇论文中，Doudna的团队展现了一个名为DETECTR的系统，它可以准确地识别人源样本中不同类型的 HPV 病毒。在另一篇论文中，张锋团队则展示了性能优化的 SHERLOCK 系统，该系统于去年开发成功，用于检测人源样本中的寨卡病毒，登革热病毒以及其他有害细菌。

这两篇论文共同证明了 CRISPR 的巨大潜力，而不仅仅只用于基因组编辑。

“它使新一代诊断技术成为可能，并且比目前的技术更具成本效益” ，罗切斯特大学生物化学和生物物理系的助理教授 Mitchell O'Connell 说。

Doudna 团队：100%准确检测出 HPV 16 感染

在《Science》发表的研究中，Doudna 团队使用的是 CRISPR-Cas12a 系统。他们发现一个很有趣的现象：这种 CRISPR 系统在剪切靶向的双链 DNA 的同时，Cas12 的 DNA 酶活性会被激活，而该酶能非特异性切割单链 DNA（ssDNA）。

该研究的共同作者，加州大学伯克利分校实验室研究员 Janice Chen 对此表示：“这是一个意外但是很‘疯狂’的发现。”

图丨DETECTR 工作原理

之所以说这是一个“疯狂”的发现，是因为这个发现为细胞内检测是否含有某目的DNA 提供了一个全新的思路：同时向细胞内递送靶向该 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系统和非特异性 ssDNA 荧光报告基因（FQ-labeled reporter），一旦检测到目的 DNA，CRISPR-Cas12a 系统将启动，与此同时，荧光报告基因也会被降解，从而释放出荧光信号。

基于此，Chen和她的同事们开发了一种可用于诊断病毒感染的新型诊断工具，并通过与等温核酸扩增技术的联用提高了灵敏度。该工具被命名为DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，简称 DETECTR。

到目前为止，科学家们已在试管水平证明 DETECTR 可以100%准确地检测出HPV16感染，92％准确地检测出 HPV18 感染。HPV16 和 HPV18 能增加患者发生癌症的概率，是两种特别危险的HPV 亚型。

“当然，我们还需要不断改进该系统。但从原则上来说，这个想法是可行的，我们真的很兴奋。”Chen说。

令人欣喜的是，相比于其他测试，DETECTR测试价格低廉且快捷：单次成本不到一美元，只需一个小时。

现在，Chen和她的团队正在努力开发能轻松读取荧光信号的硬件设备。他们还想测试系统是否能响应其他人源样本，如血液，唾液或尿液。

张锋团队：灵敏度提高100倍，可检测多种病毒

去年，张锋团队向公众展示了 SHERLOCK 如何利用 CRISPR-Cas13a 在多种人类样本（如唾液）中发现寨卡，登革热的 RNA 序列，甚至一些与癌症突变相关的序列。

而今，SHERLOCKv2 诞生了。与 SHERLOCK 相比，其灵敏度提高了100倍，并能在同一样品中检测出多种病毒感染，比如能同时检出寨卡 和登革热病毒。

之所以能达到这样效果，是因为他们在 SHERLOCKv2 中引入了多种来自不同种属细菌的 Cas13 酶，如 LwaCas13a 和 PsmCas13b。

图丨CRISPR-Cas13a

这些不同的 Cas 酶对不同的RNA序列表现出不同的“偏爱”程度。换句话说，同时向细胞递送多种酶和多种不同荧光的报告基因，一旦 CRISPR 系统发现目的基因，对应的Cas13就会启动剪切酶活性，剪切相应的荧光报告基因，从而释放出荧光信号。

这原理其实和 Doudna团队的 DETECTR 基本一致，只不过张锋团队设计的荧光报告基因必须是特异性，而 Doudna 团队则是非特异性的。然而，也正是“特异性”这个优点使得 SHERLOCKv2 可以同时检测多种序列。

同样相似的思路是，为了提高灵敏度，张锋团队也引入了等温核扩增技术。但是除此之外，他们向体系中还引入了CRISPR type-III中的Csm6酶。Csm6酶的特异性切割序列为环腺苷酸分子和末端为2’,3’-环磷酸的线性腺苷酸。他们发现通过设计CRISPR系统使得Cas13剪切后的序列是Csm6酶的靶向序列，能大大提高灵敏度。

“这些放入一个管中的所有酶，它们不仅相互作用发挥了更好的作用，而且让我们得到了珍贵的生物学信息。这真是太棒了，充分向我们展现了生物化学的强大力量”，论文的共同作者，来自张锋实验室的博士生 Jonathan Gootenberg说。

目前，病毒感染诊断一般包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测，不仅耗时长，而且对医疗设备和操作人员的专业水准要求很高。因此，如果能开发出一种不需依赖贵重设备和医护人员的智能诊断设备显得非常重要，尤其对于病毒感染经常肆意横行的发展中国家。

而与 DETECTR 相比，张锋团队论文所描述的诊断工具SHERLOCKv2离这样的目标更进一步。

图 | SHERLOCK 试纸检测结果展示

像 DETECTR 一样， SHERLOCK 也使用荧光信号作为输出。但是不仅仅限于此，张锋团队还开发了类似于验孕棒一样的试纸检测方法。现在，不需要任何特殊设备，只需一张试纸，SHERLOCKv2 就能显示出病毒感染检测结果，非常易于使用。

“试想一个很糟糕的情况，没有任何能源如电力。然而只要有样品，SHERLOCKv2 试纸就能在现场发挥作用”，O'Connell 称。而且它也很便宜：SHERLOCKv2 试纸只需几美元。

虽然 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我们展现出它们在诊断中的强大力量，但是在进入临床使用前，研究者们仍有很多工作需要做以确保诊断的准确性。

不过，相信这些新诊断工具绝对将改写未来的诊断技术，尤其将给那些缺乏先进设备和训练有素的人员的发展中国家带来很大不同。“它有影响人类健康和全社会的真正潜力”，来自张锋实验室的另一位博士生、该论文的共同作者Omar Abudayyeh说。

总而言之，两支团队正在开发的这些基于CRISPR、用于快速诊断感染的便宜设备，有望为全球，特别是发展中国家的病毒（如 HPV 和寨卡）感染诊断，带来一场真正的革命。

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