测序技术革新，tRNA终于有出头之日了！

　　作者：解螺旋.子非鱼 解螺旋原创

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　　在RNA演艺圈中，相对于其他闪闪发光，演艺事业如日中天的mRNA，tRNA就像被雪藏很久的实力派演员，总是因为低调和保守而难以被重用。（高通量RNA测序技术无法检测高度修饰或大量折叠的tRNA。）近日终于有慧眼识英雄的星探出现了，《Nature Methods》上发表的两篇文章提出，使用两种方法可以在cDNA文库制备前去除tRNA的修饰，因此解决了tRNA测序的技术难题。

　　在基因表达界展现低调的华丽

　　tRNA是保证基因表达翻译正常进行的守护者，tRNA与特定氨基酸结合，并将它们运送到核糖体，让这些氨基酸在核糖体连接形成蛋白质。正因为有tRNA的保驾护航，细胞才能将遗传密码翻译成为使细胞得以安身立命的功能性蛋白质。

　　有人说，tRNA再重要也只是个“搬运工”，研究它有卵用？最近的研究表明，tRNA表达与神经体统疾病和癌症的发展有关。tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一些小的tRNA分子，其中一些参与了细胞的增殖。前不久，有研究发现，一些tRNA片段能够抑制乳腺癌的发展。这些研究成果表明，tRNA妥妥是基因表达调控研究领域的明日之星。

　　tRNA研究的羁绊：现真身的困难

　　要研究tRNA，首先要让他们现真身，然而，RNA测序技术却对此有心无力，为什么？RNA测序就是在RNA的末端加上接头，再利用3’端接头互补的引物进行逆转录。tRNA有稳定的三级结构，且有许多修饰，甲基化、核苷内的转位反应、还原反应等，因此不容易敞开心扉，接头难以接上去，cDNA合成困难。

　　tRNA研究者的福音来了！

　　不过，现在技术得到更新了！近日，在NATURE杂志上发表文章的两个研究小组提出开创tRNA测序新纪元的方法：脱烷基化酶AlkB去甲基测序法，它是使用大肠杆菌脱烷基化酶AlkB作用于广泛存在于tRNA上的甲基化碱基，使其去甲基化，因此，去甲基化的tRNA就能在高通量测序中被发现形成cDNA文库。

　　芝加哥大学的研究小组提出一种称为DM-tRNA-seq的方法，利用一种热稳定的逆转录酶（TGIRT）来代替普通的逆转录酶。这种酶能持续合成来自高度结构化tRNA的cDNA，从而省去了接头连接的步骤。他们发现采用这些策略在HKE293T细胞中实现了高效的tRNA测序。

　　第二个研究小组则开发出一种称为ARM-seq的方法。与第一种方法不同，这种方法需要在成熟RNA的两端添上接头。它不如模板转换高效，但确保只有全长的转录本（成熟的tRNA、tRNA前体和tRNA衍生的小RNA）才被PCR扩增和测序。ARM-seq能够准确捕获已知的修饰位点，并鉴定出tRNA中的新位点。

　　这两种方法提供的实用程序，能让我们识别以前忽略的甲基修饰RNA，可以有效地监视甲基化状态，并揭示作为未来的生物标志物或信号分子的tRNA片段的真面目。mRNA和非编码RNA也有甲基化修饰，应用上述两种方法，或许可以发现前所未有的mRNA和非编码RNA。