环状RNA测序的样本选择、分析方法
RNA测序分析来自6个正常组织(脑、结肠、心脏、肝、肺、胃)和7个癌症组织(膀胱尿路上皮癌、乳癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌)的去核糖体RNA后的总RNA,发现了67,358个潜在的环状RNA,其中27,296含有至少两个unique back-spliced reads。
研究者使用RefSeq database 24对这些环状RNA进行注释;环状RNA表达差异使用Wilcoxon rank-sum test计算,比较癌症样本与相应正常组织样本。
初步鉴定预测的新环状RNA
为排除它们是线性的反式剪接产物,研究者检测了它们的物理特性。针对36个共同表达的待鉴定环状RNA转录本,设计了Outward-facing引物。每对引物分别扩增一个来自HEK-293T cDNA的不同产物。在RNase R处理后,全部36个back-spliced序列都明显存在。
选择哪个环状RNA继续下游功能研究呢?
通过锚点比对 (Anchor alignment),根据它们的线性形式,给测序数据中每一个环状RNA进行丰度定量。研究者检测了它们的5’端和3’端成环比 (circular ratio,CR),以5’ CR>0.2; 3’ CR>0.2; SRPBM>1为标准时,得到了990个高丰度表达的环状RNA。研究者留意到,这里面的其中一个环状RNA来自于HIPK3基因Exon2,命名为circHIPK3,丰度与back-spliced(反向剪接)比都很高。
多维尺度法筛选高丰度circRNA。红点和黑点分别表示高丰度和低丰度circRNA,circHIPK3以蓝点显示。灰色部分为筛选得的高丰度circRNA。
环状RNA研究第一步:鉴定环状
研究者使用outward-facing引物扩增出了预期大小的不同产物,并通过sanger测序确定了序列。环状的表达水平通过qRT-PCR检测,结果与RNA-seq一致,在多种组织里的表达量均高于其线性形式。
然后研究者检测了它在HeLa细胞中的稳定性和定位情况,用Actinomycin D(转录抑制剂)处理细胞后,环状RNA仍具有高稳定性,并能抵抗RNase R外切酶消化,表明它确实为环状形式。
e) qRT-PCR显示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa细胞质或核。f) circHIPK3的RNA FISH实验。
circHIPK3是如何形成的?
HIPK3 Exon2两侧的外显子分析显示,高度互补Alu重复序列与28个短散在重复序列 (SINE) 处在HIPK3 Exon2上游的内含子中,51个SINE处于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技术,去除了HEK-293T细胞中的circHIPK3侧翼Alu序列,结果发现下游Alu序列删除后,环化被抑制,但上游Alu删除后不仅没有减少circHIPK3的生成,还稍微增加了。
示意图显示基因组上HIPK Exon2区域含有侧翼Alu重复序列和长内含子。Alu元件和长内含子使用CRISPR/Cas9系统进行删除(gRNA1-6)。在gRNA两侧的引物用于检测删除效果(P1-5)
引物环状外显子的上游有许多Alu元件,研究者猜测内含子中有其他Alu元件可能促进环化,于是删除了上游大的内含子 (gRNA5、gRNA6),结果circHIPK3显著下调,而HIPK3 mRNA没有变化,证明删除只影响back spilcing,而不影响典型的剪接,表明带Alu互补重复序列的侧翼长内含子,是circHIPK3生成所必需的。
使用4对gRNA把序列删除(gRNA3-6),进行普通PCR和qRT-PCR,引物位点设计在删除区域外(P4+P5)
RNA是怎样变成环状的呢?
a. 在可变剪切过程中,外显子迁移,剪切形成套索结构,拉近剪切位点,促进序列成环
b. 依赖邻近的反向互补序列配对,拉近剪切位点,使其相互攻击,促进序列成环
c. 单个内含子直接成环
d. RNA结合蛋白、反式作用因子参与成环
研究功能,敲降看看
据文献报道,环状RNA可以被小干扰RNA敲降7。如下图所示,研究者使用了三种siRNA:一种靶向backsplice序列 (si-circHIPK3),一种靶向线性转录本 (si-HIPK3),一种靶向线性和环状共有的环状外显子 (si-both)。接着,研究者通过细胞增殖实验及EdU染色观察敲降后的情况,发现si-circHIPK3能抑制几种不同的细胞生长,而si-HIPK3不能。
通过EdU试验,检测转染3种siRNA 48h后Huh-7细胞的DNA合成情况。
circHIPK3充当miRNA海绵
来自doRiNA的AGO2 CLIP-Seq公开数据显示AGO2位于circHIPK3区域。研究者进行了pull down、荧光素酶报告基因实验,证明了circHIPK3可能是AGO2和miRNA结合的中间媒体。
为了寻找与circHIPK3结合的miRNA,研究者使用荧光素酶筛选miRNA文库。在424个miRNA中,有9条miRNA能够显著减弱荧光素酶报告基因活性。使用TargetScan和PicTarmiRNA预测软件,发现它们含有circHIPK3区结合位点。于是研究者把这些结合位点突变了,转染突变后的miRNA,并不能减少报告基因活性。此项结果表明circHIPK3可能是这些miRNA的海绵 (sponge)。
HEK-293T细胞转染424个miRNA mimic,进行荧光素酶报告基因实验筛选,鉴定它们是否能够与circHIPK3结合。图中标注的9个miRNA对酶活抑制较明显。
值得注意的是,这9种miRNA都能抑制细胞生长,其中miR-124效果最显著,于是研究者使用生物素偶联的miR-124 mimic,富集了大量circHIPK3。多个实验的结果综合表明,circHIPK3能够直接结合到miR-124,抑制其活性。
左图:HEK-293T细胞转染3‘偶联链霉亲和素的miR-124后,捕获得的细胞裂解液中circHIPK3水平;右图:转染si-cHIPK3、miR-124或cHIPK3载体到HEK-293T细胞,qRT-PCR检测IL6R和DLX2表达情况。IL6R和DLX2是miR-124的两个已知的增殖促进靶标,会随着circHIPK3的敲降而下调,表明circHIPK3可以挽救miR-124对它们的抑制。
环状RNA有什么功能和作用?
1. 调控亲本基因表达仅有内含子的ciRNA与pol II结合促进基因转录有内含子+外显子的ElciRNA与U1 snRNP形成复合体,再与pol II结合,促进基因转录
2. 充当ceRNA仅有外显子的circRNA有MRE,吸附miRNA,调控miRNA表达(miRNA海绵)
3. 作为疾病的biomarker 上海研究者:Exosomes里也有环状RNA
4. 成为新的疾病治疗靶点
原文:Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215.
作者:锐博生物
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