环状RNA研究方法之RIP

　　

　　环状RNA（circular RNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发现，circRNA 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程，已成为疾病研究的热点之一。已有报道circRNA能跟蛋白结合调控亲本基因转录、调控细胞周期进展。此外，RNA与RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿和伴随了RNA的转录合成、加工和修饰、胞内运输和定位、功能发挥及降解的整个生命循环。鉴于此，利用RNA结合蛋白分离或发现鉴定功能性RNA分子是RNA研究领域中一个不可或缺的研究方法。

　　继上次“环状RNA研究方法之RNA Pull-Down”今天我们再跟大家一起学习一个研究蛋白质与RNA相互作用的关键技术——RNA Immunoprecipitation，又称RIP，RNA结合蛋白免疫沉淀技术，即利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白结合的RNA，再通过QPCR、芯片、测序技术对这些RNA进行鉴定。

　　RNA Immunoprecipitation Protocol

　　

　　Ribonomics RIP-Assay Kit Procedure

　　材料准备

　　试剂

　　?1 M dithiothreitol (DTT; Fermentas, cat. no.RO861)

　　?EDTA (EM Science, cat. no. 4005)

　　?Glycogen (Roche, cat. no. 10901393001)

　　?1 M HEPES (pH 7.0; Sigma, cat. no.H3375)

　　?IgepalNonidet P-40 (NP40; Sigma, cat. no.I-30201)

　　?1 M KCl (Mallinckrodt, cat. no. 8648)

　　?1 M MgCl2 (EMD Bioscience, cat. no. MX0045-1)

　　?Protease inhibitor cocktail tablets (Roche, cat. no. 11697498001)

　　?Protein A, immobilized on Sepharose (Sigma, cat. no. P3391)

　　?Proteinase K (Roche, cat. no. 1964364)

　　?RNase Out RNase inhibitor, 100 units/ml (Invitrogen, cat. no. 10777-019)

　　?1 M NaCl (Mallinckrodt, cat. no. 7581)

　　?Sodium dodecyl sulfate (SDS; EMD Bioscience, cat. no. 7910)

　　?1 M Tris-HCl (pH 7.4; JT Baker, cat. no. 4103-01)

　　?Trizol (Invitrogen, cat. no. 15596-026)

　　?Urea (Mallinckrodt, cat. no. 8648)

　　?Vanadyl ribonucleoside complexes (VRC; New England Biolabs, cat. no. S1402S)

　　溶液

　　使用RNase-DNase?free H2O 制备溶液

　　?Polysome lysis buffer：

　　100 mMKCl

　　5 mM MgCl2

　　10 mM HEPES (pH 7.0)

　　0.5% NP40

　　1 mM DTT

　　100 units ml?1 RNase Out

　　400 µM VRC

　　?Protease inhibitor cocktail ：

　　制备5 ml 的polysome lysis buffer： 在4.7 ml RNase-DNase?free H2O中加入 50 µl 1 M HEPES (pH 7.0), 500 µl 1 M KCl, 25 µl 1 M MgCl2, 25 µl NP40。

　　在使用前加入50 µl 1 M DTT, 12.5 µl 100 U/ml RNase Out, 200 µl Protease inhibitor cocktail (根据说明书溶解Protease inhibitor cocktail tablets ) ,10 µl 200 mM VRCs.

　　?NT2 buffer：

　　50 mMTris-HCl (pH 7.4)

　　150 mMNaCl

　　1 mM MgCl2

　　0.05% NP40

　　制备50 ml 的NT2 buffer, 在 40 ml 的RNase-DNase?free H2O中加入 2.5 ml 1 M Tris (pH 7.4), 7.5 ml 1 M NaCl, 50 µl 1 M MgCl2,25 µl NP40。

　　实验步骤

　　1

　　准备mRNP lysate

　　Timing:1h

　　1) 收集到足够的细胞提取2~5mg总蛋白用于RIP。大概需要5~20 * 106哺乳动物细胞。1,000g 4 °C离心10 min 收集细胞，在离心管中加10ml 冰冷的PBS洗涤若干次。用于RIP的蛋白量需根据RNA-binding protein的丰度以及检测RNA的方法进行优化。

　　2) 使用同样体积的polysome lysis buffer （+ RNase inhibitors，protease inhibitors）重悬cell pellet，成团的细胞需使用移液器吹打几次吹散。将mRNP置于冰上5min或储存于-100°C冰箱。裂解物可以在-100°C保存数月。一些特定种类的细胞可能需要注射器的针头吹散。

　　2

　　抗体包被 protein A/G beads

　　Timing: ~15min

　　1) 在 4 °C，使用前预先将protein-A Sepharose beads和NT2（+5% BSA）按1:5的比例混合孵育1h。也可以根据抗体的不同选择 Protein G 或 A/G Sepharose beads。 在1.5ml 离心管中加入 250?500 µl protein A?BSA slurry，短暂离心后将在离心管底部形成约?50 µl 的pelleted bead.

　　2) 在bead slurry中加入抗体，4 °C翻转孵育2~18h。加入抗体的量由抗体的效价决定，但要足够拉下所有的目的蛋白。 在使用之前，使用1ml冰冷的NT2 buffer洗涤antibody-coated beads 4~5次。洗涤将除去未结合的抗体，以及RNases等污染物。 洗涤过程：在4°C短暂离心beads，出去上层液体，然后用冰冷的NT2 buffer重悬，颠倒离心管几次混匀。

　　3) 最后一次洗涤后，使用850 µl 冰冷的NT2 buffer重悬beads。加入200U的RNase inhibitor (5 µl RNase Out)，2 µl Vanadylribonucleoside complexes(至终浓度 400 µM), 10 µl100 mM DTT 和 20 mMEDTA。

　　3

　　免疫沉淀反应和RNA沉淀

　　Timing ~6h，包括结合和孵育时间

　　1) 将mRNP lysate在冰上融化，15,000g离心15min去除沉淀。将上清转移至离心管，置于冰上。如果直接使用cell lysate 可以减弱背景。但是会降低信号。 QC1: 作为Input sample, Western检测cleared lysate中是否有目的蛋白。

　　2) 在Step 2.5中的抗体+beads的混合物中加入100 µl的precleared lysate. 这一步可以降低非特异结合。 立刻使用手指颠倒混匀离心管数次，8,000?10,000g短暂离心，沉淀beads。取100 µl的上清，可以代表total cellular RNA。 QC2: 用RT-PCR检测total cellular RNA中目的RNA片段。

　　3) 在4 °C颠倒摇晃孵育4 h，或者在室温 (18?25 °C) 孵育2h。在一些情况下也可以，孵育时间可以短至15min。

　　4) Pellet beads和上清可以保存在–20 °C保存数月，用于以后分析。

　　5) 使用 1 ml冰冷的NT2 buffer洗涤beads 4~5次，短暂离心后，去除上清。

　　6) 使用100 µl NT2 buffer重悬beads。NT2 buffer 中可以加入30µg的蛋白酶K以释放RNP成分。将混合物在55 °C孵育30min，期间使用手指颠倒混匀离心管数次。

　　7) 释放RNP成分并从免疫共沉淀的pellet中纯化RNA。直接在beads 上加入Trizol(Invitrogen)或苯酚-氯仿-异戊醇。沉淀RNA然后重悬于一定体积的溶液中（根据接下来的检测方法而定）。在沉淀反应中加入20 µg的糖原可以RNA pellet更加直观，帮助回收RNA。

　　8) 在RNP成分释放后，可以分离复合物中的蛋白质，然后用质谱或其他蛋白组学的方法检测蛋白质。这些信息对于进行得到的RNA的功能分析非常重要。

　　相关试剂盒

　　Ribonomics：RIP-Assay Kit

　　Merck Millipore: Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kits

　　Sigma: Imprint®RNA Immunoprecipitation (RIP) Kit

　　参考资料

　　[1] McHugh C A, Russell P, Guttman M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions[J]. Genome Biol, 2014, 15(1): 203.

　　[2] RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.

　　[3] Ribonomics RIP-Assay Kit Instructions.

　　来源：永诺生物

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