FUT1基因突变导致类孟买血型的分子机制

　　作者：蔡晓红 林琳 陆晔玲 戴菁 龚淞颂 王钰箐 叶瑾 王勤 沈敏 沙青 刘志刚 邹纬 王学锋

　　选自：中华检验医学杂志, 2015,38(11): 765-767

　　红细胞上A和B抗原形成的前体物质是H抗原。ABO基因座决定A和B抗原的生成，而α1，2–岩藻糖基转移酶基因FUT1(或H)和FUT2(或Se)决定A和B抗原前体H抗原的生成[1]。在类孟买血型中，ABH抗原无法正常表达于红细胞表面，但分泌物中可以含有ABH物质[2]，血清中含有较强的抗H抗体，因此类孟买血型可导致ABO定型不符和输血困难。对类孟买血型分子机制的研究有利于正确鉴定血型和临床安全输血。类孟买血型个体通常具有缺陷的FUT1基因和正常的或弱表达的FUT2基因。

　　一、对象

　　筛选2014年6月至2015年5月间类孟买血型对象3名。个体1为上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科患者，男性，65岁，汉族，上海籍；个体2和个体3分别为福建籍和湖北籍献血者，均为外地血站送检上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科的疑难血型鉴定标本。随机选择120名ABO血型正常的献血者作为对照。排除标准：患有血液系统疾病或骨髓移植、造血干细胞移植等治疗状态下的患者，以及血型抗原发育尚不完全的新生儿。

　　二、方法

　　1．血型血清学检测：

　　采集3.2%柠檬酸钠抗凝外周血液，ABO正反定型和抗体筛选使用全自动血型仪Biovue(美国强生公司)和IH–1000(美国Bio–Rad公司)进行初次检测，按血型参比实验室标准操作方法进行试管法复检，单克隆抗–A，抗–B，抗–AB，抗–H，反定型ABO细胞和抗体筛选细胞为上海血液生物制品公司产品；单克隆抗–Lea和抗–Leb为Sangqin公司产品。多克隆抗–A，抗–B为自制试剂。采用吸收放散实验[3]检测红细胞上是否存在少量的A、B抗原。在缺乏唾液标本的情况下，通过检测Lewis血型间接推测个体的分泌型。

　　2．DNA抽提和PCR扩增：

　　基因组DNA抽提采用外周血DNA抽提试剂盒(北京TianGen公司)。PCR分别扩增ABO基因第6、第7外显子，FUT1基因和FUT2基因，使用的引物和扩增条件参照文献报道[4]。

　　3．PCR产物直接测序和克隆后测序：

　　采用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒(北京TianGen公司)纯化ABO基因第6、第7外显子，FUT1基因和FUT2基因扩增的PCR产物，将FUT1基因扩增产物克隆入pMD18–T载体(日本TaKaRa公司)，PCR插入片段随后在ABI 377测序仪(美国Applied Biosystems公司)上进行序列分析。ABO基因第6、第7外显子和FUT2基因扩增的PCR纯化产物直接进行测序。120名健康对照的FUT1基因采用相同方法进行扩增、纯化和测序。等位基因命名遵循BGAGMD(血型抗原基因突变数据库)里的术语[5]。

　　4．新突变的3D分子模型构建：

　　采用Phyre2软件进行突变蛋白3D分子模型构建[6]。由于蛋白质数据库(PDB)中尚未有人FUT1酶的晶体结构，因此，以同源性fucosyltransferase nodz from bradyrhizobium蛋白为模型构建FUT1蛋白。结构图的绘制采用PyMol软件(Version 1.4.1)。

　　三、结果

　　1．血清学鉴定结果：

　　本研究中涉及的3名中国籍个体的血清学结果及相应基因型见表1。标本1使用全自动血型仪检测ABO血型和抗体筛选的结果见图1。

　　图1

　　含有新突变的h11(China; RJ)FUT1等位基因个体的ABO血型和抗体筛选结果

　　2．DNA测序分析：

　　3名类孟买个体的ABO基因分别为B/B、B/O和A/O基因型，FUT2基因分别为Se357纯合子，在FUT1基因分别存在764–768delC/658T、547delAG/547delAG、547delAG/658T突变；其中FUT1764–768delC突变为新突变(图2B)，其等位基因已提交GenBank，序列号KM514482，相关等位基因我们命名为h11(China; RJ)。在120名正常样本中未检出此突变。

　　图2

　　h11等位基因个体FUT1基因测序结果

　　3．突变对酶的结构影响分析：

　　采用Phyre2构建野生型人类α1，2–岩藻糖基转移酶和FUT1 764–768delC突变型。软件根据结构同源性，对野生型第80–319位氨基酸、突变型第80–270位氨基酸之间的区域进行了构建，形成的α1，2–岩藻糖基转移酶催化区3D分子模型结构图分别见图3。野生型在此区段形成8个α螺旋，突变型较野生型少了256位Pro后的3个α螺旋。

　　图3

　　野生型人FUT1酶和FUT1 764–768delC突变型3D分子模型

　　四、讨论

　　1952年Bhende等描述了来自印度孟买的异常血型，红细胞是O型，但是H抗原阴性，血清中均含有抗–H。这种红细胞H缺乏型的非分泌型血型后来被称为孟买型(Bombay)。在孟买，表型频率大约在1/7 600，H的基因频率是0.011 5。在印度洋Reunion岛聚集区来源丰富。1965年Solomon等描述了第一个红细胞上缺乏H，却可以分泌H物质的家庭。红细胞上具有很少或没有H，A和B抗原，然而分泌液中含有正常数量的H，A和B。由于个体的红细胞上的H缺陷与孟买型类似，但分泌状态与孟买型有所区别，因此这种表型随后被称之为类孟买型(Para–Bombay)。类孟买血型即红细胞H缺乏型的分泌型。类孟买型在不同种族和群体中存在差异，文献报道在泰国的频率在1/5 000，台湾1/8 000，香港1/15 620。类孟买血型在我国的报道主要见于南方，福建地区频率约为1/8 500，而云南少数民族拉祜族中的频率高达2.2.%[7]。本研究3例类孟买血型根据以下特征鉴定：(1)红细胞上未检出H抗原，而红细胞上A、B抗原的含量也仅能通过吸收放散检出。(2)通过Lewis血型鉴定，他们均为Lewis(a–b＋)血型，即分泌型个体。(3)他们的血清中均检出抗–H特异性抗体。个体ABO血清型均与ABO基因型相一致。值得注意的是，进行ABO血型鉴定时，由于反定型受到血清中抗H的干扰，反而出现ABO正定和反定均是"O型"的格局，在使用全自动血型仪进行血型鉴定时并未提示血型鉴定异常，而按照"O型"报出结果。因此临床ABO血型检测中，应同时加做反定型的O细胞或进行抗体筛选检测，当仪器报出O型且反定型O细胞出现凝集或抗筛阳性疑似抗H抗体时，提示需要进行红细胞H抗原检测，防止漏检类孟买血型。

　　类孟买血型红细胞上的H抗原表达受控于α1，2–岩藻糖基转移酶基因(FUT1或H)。FUT1基因位于19号染色体长臂，有4个外显子，编码蛋白的序列位于第4外显子，合成的糖基转移酶由365个氨基酸组成。国际上目前报道的与H抗原缺陷相关的FUT1等位基因有50余种[5]，在我国，最常见的是最早在台湾发现的h1，h2以及h3等位基因，突变点分别是FUT1 547delAG，FUT1 880delTT和FUT1 658C>T[8]。本研究涉及的个体中也存在h1和h3等位基因，此外个体3还有一个新突变FUT1 764–768delC，且这一突变在正常个体中未检出，从而排除了其为中国人群FUT1基因多态性的可能。FUT2基因与FUT1高度同源，控制个体的分泌状态，FUT2基因测序显示，这些个体均为中国人群常见野生型FUT2等位基因Se357纯合子，与其从Lewis血型推测的分泌状态一致。

　　本研究检出的新突变FUT1 764–768delC导致a–(1，2)–岩藻糖基转移酶出现终止密码子(premature terminate coden，PTC)。许多携带PTC的哺乳动物突变mRNA会被一种称之为无义介导的降解途径(nonsense–mediated decay，NMD)选择性的破坏而清除[8,9,10]。据认为NMD作为一种mRNA监视系统选择性清除编码C–端截短蛋白的突变mRNA分子以避免无功能的蛋白聚集带来的负性影响。遗憾的是，本研究由于无法获得新鲜样本，故不能进行个体3外周血cDNA定量PCR分析，获得FUT移码突变mRNA和点突变mRNA相对表达量的比较数据，从而验证是否存在NMD导致h11转录本减少的现象。而且，即使没有NMD机制存在，由于突变酶比野生型蛋白少编码了109个氨基酸，我们推测生成的酶也没有活性。突变蛋白从257位氨基酸开始发生移码，并且编码22个移码突变的氨基酸后出现PTC，因此在二级结构上失去3个a螺旋结构，影响到FUT1酶的空间构象，导致酶催化活性中心的空隙变大(图2B)，无法与酶的底物和供体紧密结合，使α1，2岩藻糖基转移酶完全失去活性，不能在红细胞上合成H抗原。此外，个体3的另一条染色体的FUT1基因上存在突变658C>T，是一个在中国类孟买个体中较为常见的一个突变点[5,7,11,12,13]，最终导致其编码的a–(1，2)–岩藻糖基转移酶活性失活或急剧下降，不能有效合成H抗原，形成类孟买血型。

　　参考文献：略