)衰老是人类疾病最大的危险因子，而器官和组织退行通常是衰老特定阶段的表现形式，同时多种衰老相关疾病（神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和肿瘤）也伴随衰老而发生。一般认为，衰老若得以延缓，则可能从根本上减少一系列老年疾病的发生，因此，深入认识衰老的本质是延缓衰老及防治老年疾病的重要前提。然而，我们目前对人类衰老的特征标志物及驱动因素却知之甚少。
2017年1月31日，中科院生物物理研究所刘光慧课题组和徐涛课题组，以及中科院动物研究所曲静课题组合作在Nature旗下Cell Research杂志在线发表了题为"Visualization of Aging-Associated Chromatin Alterations with an Engineered TALE System" 的研究论文。该研究发展了一种新型三维基因组活细胞成像工具，利用此工具实现了对衰老伴随的端粒缩短和着丝粒异染色质改变的精准成像。更为有趣的是，该研究发现了核仁区核糖体DNA拷贝数的减少可以作为人类衰老的新型标志物。这些成果为在遗传和表观遗传水平认识人类衰老的本质奠定了重要基础。
近年来，随着CRISPR/Cas9和TALE等新型核酸结合蛋白的发现和应用使得对基因组特定序列的精准成像成为可能。然而，目前基于CRISPR/Cas9和TALE的成像系统尚存在一定的不足。CRISPR/Cas9系统的主要问题是由于其涉及多种蛋白和RNA元件，且Cas9蛋白分子量较大，因而该系统在哺乳动物细胞中瞬时表达存在难度，同时利用该系统成像时细胞核背景噪音也较高。TALE系统虽然理论上蛋白分子量小，并且可以直接结合DNA，但就目前发表的论文而言，尤其是利用人类细胞进行的基因组成像研究中，很少使用三维荧光原位杂交（3D-FISH）这一“金标准”实验对TALE的成像的精确度进行严格确证。
在该项研究中，研究人员通过对传统TALE介导的端粒、着丝粒和核仁区核糖体DNA等基因组重复序列的成像结果进行细致分析，发现利用传统的TALE标记基因组重复序列时会在细胞内产生异常的聚集斑块（aggregates），且这些聚集斑块多数情况下脱离了基因组上的DNA靶序列，因而极大地限制了TALE在染色质三维成像中的应用。研究团队通过筛选一系列可提高细胞内蛋白溶解性的“助溶解多肽”，发现硫氧还蛋白（Thioredoxin）与TALE的融合表达（该融合蛋白称为TTALE）能够特异地清除TALE成像时伴生的聚集斑块，从而最大程度地释放TALE在染色质三维成像方面的效能。实验结果表明，同Cas9相比，TTALE具有成像信噪比高、易于操作等优点，可广泛应用于胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞（间充质干细胞和神经干细胞）、终末分化细胞（神经元和血管平滑肌细胞）、肿瘤细胞以及卵细胞等多种人类细胞类型。此外，利用该工具，研究者们首次实现了对28S核糖体DNA的活细胞标记，并揭示28S核糖体DNA主要分布于核仁区的外周，这将为理解核糖体DNA和核仁在多种生命过程中的功能提供重要的线索和研究工具。
Figure 1：TTALE介导的28S核糖体DNA在细胞核仁区的精准成像
Movie 1.利用TTALE成像系统实时观测HeLa细胞有丝分裂过程中端粒和着丝粒的动态变化。
人类衰老和许多衰老相关的疾病都伴随着染色质结构的改变或异常，因此探索染色质结构的动态变化对于深入理解衰老及衰老性疾病的机制具有重要的意义。基因组重复序列是隐含在人类基因组中的“暗物质”，通常被包裹在致密的异染色质中，并且被认为是无用的“垃圾序列”。由于研究手段的限制，在现有的大多数基因组信息分析中，这些“垃圾序列”往往会被主观地“忽略”掉。人们所熟知的端粒其实也是一种基因组重复序列，而端粒的缩短已经成为衰老研究领域中为数不多的重要分子标记物之一。尽管如此，对于衰老是否伴随更为广泛的基因组重复序列的改变，目前人们还知之甚少。利用TTALE成像系统，研究团队发现核仁区核糖体DNA拷贝数的减少可能是人类衰老的生物钟之一。人类衰老所伴随的核仁区核糖体DNA拷贝数的减少同端粒的缩短同样显著，并且可以方便地在老年人的外周血中检测到，因此可以用作评价人类衰老进程的新型分子标志物。此外，研究人员也利用TTALE系统在培养皿中观测到了细胞衰老伴随的端粒缩短和着丝粒异染色质失序等基因组结构的变化，并且首次在体内单细胞水平观察到了端粒酶缺失小鼠的端粒加速缩短现象。
Figure 2：TTALE成像系统可用于精准观测衰老伴随的端粒缩短、核仁区核糖体DNA拷贝数的减少，以及着丝粒异染色质去致密化等染色质结构的改变
这些发现为揭示人类染色质三维结构及其动态变化在衰老和疾病中的作用提供了强有力的研究工具。此外，全新人类衰老分子标志物的确立也将为衰老的基础和转化研究提供助力。
该项工作由中科院生物物理所、中科院动物所、北京大学第三医院、国家卫计委北京医院，首都医科大学附属北京世纪坛医院，以及杭州师范大学等机构合作完成，受到科技部、基金委、中科院和北京市等项目资助。中科院生物物理所刘光慧研究员、徐涛研究员以及中科院动物所曲静研究员为共同通讯作者。生物物理所副研究员任若通博士、薛艳红博士以及博士研究生邓丽萍为并列第一作者。
文章链接:https://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201718a.html
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