图解 | Cell三篇牛文详解CRISPR两大家族及操作法则

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　　作者：子非鱼（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

　　近日，CRISPR专利大战以张锋一方获胜而暂告一段落。显然，早已风靡生物医学界的CRISPR凭此又火了一把，而Cell杂志三篇牛文则对CRISPR系统及操作进行了详细地归纳总结，可让大家真正掌握CRISPR基因编辑技术之精髓。

　　CRISPR两大家族

　　CRISPR-Cas系统是原核生物中的适应性免疫系统，而基于效应蛋白可分为两个不同的类别:Class 1和Class 2。其中，Class 2系统（尤其是基于核酸酶Cas9的系统）已成为最热门的基因编辑工具。

　　1类CRISPR家族

　　Class 1系统被分为3个类型、12个亚型（如下图）。多种细菌和古细菌中均含有该类系统，比如嗜热微生物中富含1类III型CRISPR-Cas系统。

　　除了常见的Cas蛋白外，1类CRISPR-Cas系统中还有一些其他辅助性蛋白，如逆转录酶（RT）、CARF蛋白家族。

　　该系统在形成获得性免疫记忆时，除了一些不走寻常路的III-B系统（对逆转录酶情有独钟），其他的则是完全仰仗Cas1和Cas2这两个左膀右臂，尤其对Cas1的核酸酶活性十分依赖。通常Pre-crRNA会携手Cas6e/ Cas5d进化为成熟crRNA，并结合相应蛋白组装成复合物形式；而后在外源分子入侵时，复合物会招募御用的Cas3核酸酶对“侵略者”进行切割瓦解。

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　　正所谓，道高一尺魔高一丈。外源“侵略者”也不是好欺负的，为了抵抗细菌的这套CRISPR免疫系统，已有某些噬菌体能够编码多种抗CRISPR蛋白（Anti-CRISPR Protein），来进行免疫逃逸。

　　2类CRISPR家族

　　目前，2类CRISPR-Cas系统被分为3种类型、9个亚型。该系统的大多数会编码Cas1、Cas2和一些辅助蛋白如Cas4，而只有VI型系统独树一帜，仅由CRISPR阵列和效应蛋白组成。

　　2类系统主要有3类效应蛋白：RuvC样核酸酶结构域（RNA酶H折叠）、HNH家族核酸酶和HEPN超家族的两个核糖核酸酶结构域。且不同于1类CRISPR，CRISPR/Cas9系统在清除外源基因的过程中有着特殊的机制：首先需要tracrRNA，其次需要体内RNaseIII的参与。

　　另外，对外源基因常被CRISPR/Cas9系统KO的方式如下：1）tracrRNAs和pre-crRNA中的重复片段区域杂交，Cas9和crRNA-tracrRNA结合；2）RNase III从spacer的5’端开始剪切，产生不同类型的成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9的复合物；而后复合物通过PAM位点与相匹配的外源基因结合并剪切。

　　目前2类系统主要应用于以下三个方面：1）基因编辑，包括基因敲除、基因敲入以及引发突变；2）基因调控以及递送各种功能的部件（如转录因子）到DNA中特定的位置；3）靶向ssRNA。

　　CRISPR操作的中心法则

　　当外源dsDNA被注入细胞时，Cas1/2蛋白可识别外源DNA原间隔序列临近基序（PAM：三碱基NGG，N为任意碱基），并将原间隔序列（protospacer）剪切并插入到CRISPR序列前导区的下游中，完成外源DNA的捕获。

　　在I型和III型系统中，初始CRISPR转录产物（Pre-crRNA）会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 / Cas5d）在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA。

　　在II型系统中，Pre-crRNA可通过重复序列与其互补序列transacting RNA（trancrRNA）反式结合，然后在Cas9存在的情况下被RNaseIII加工融合成一个sgRNA。

　　I型和II型系统均可靶向含有与PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。不同的是，在I型系统中，通过含有多个亚型的复合物结合到dsDNA，并招募反式核酸酶Cas3对DNA进行靶向干扰。在II型系统中，则通过Cas9蛋白的HNH酶活性剪切crRNA互补的DNA链及其RuvC活性位点剪切非互补链，促使dsDNA断裂。

　　类似于I型系统，III型系统也同样依赖于具有核酸酶活性的多亚基复合物对靶向DNA进行干扰，但不同于I型和II型系统，III型系统不依赖于PAM进行靶标位点的识别，而是通过碱基互补配对来识别靶序列并进行DNA的裂解。

　　参考文献：1、SnapShot: Class 1 CRISPR-Cas Systems

　　2、SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems

　　3、SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems

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