一文教会你利用CRISPR-dCas9技术调控内源基因的转录激活与抑制

CRISPR-Cas9是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。CRISPR-Cas9系统主要有三类，其中CRISPR II类系统是目前最为广泛使用的RNA 指导核酸内切酶技术，此系统有两个主要的成分:引导RNA(guide RNA，gRNA)和核酸内切酶(Cas9)。

Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域：RuvC和HNH。这两个结构域分别负责切割DNA链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。化脓性链球菌中存在一种Cas9 D10A突变体，这种链球菌的Cas9的RuvC失活(RuvC-)，HNH仍有活性(HNH+；另一种Cas9 H840A的突变体的Cas9蛋白则呈现RuvC激活(RuvC+) 和HNH失活(HNH-)的状态，但这两种突变体的Cas9仍然具有核酸酶活性，可对靶向序列进行剪切作用。当RuvC和HNH同时处于失活状态时(D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9(dead Cas9)。dCas9虽然没有剪切DNA的能力，但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。由此，可以利用dCas9能与DNA序列结合的能力将dCas9转化为能激活基因表达的转录因子。研究发现，dCas9只有通过与其他蛋白融合后，才能够发挥转录因子的作用，促进或抑制基因的表达，并且不失去与gRNA 结合的能力。

例如：当转录激活子VP64与dCas9融合后，能够促进靶向基因的表达。但后续实验证实，若直接将dCas9与VP64融合，只能较小程度地提高转录水平。人们试着将VP64与dCas9的氨基端和羧基端融合或将dCas9与10拷贝数的VP64融合，均能提高CRISPR-dCas9对基因表达的促进作用。

当转录抑制子KRAB的Kox1结构域与dCas9融合后，能够改善CRISPR系统的作用。若没有蛋白与dCas9融合，dCas9则会干扰靶向序列的转录过程。因此，若gRNA识别的基因位点在靶向基因的启动子附近，研究者将可以通过改变dCas9的结构，以实现对靶向基因表达的调控。除了对蛋白编码区域的调节，CRISPR-dCas9系统同样能够作用于非编码RNA (lncRNAs)。例如，在人白血病细胞K562中，5种lncRNAs (H19, MALAT1, NEAT1, TERC, XIST) 都能够在CRISPR-dCas9系统的介导下，显著下调80%以上。

现在了解了dCas9的原理了，与普通CRISPR-Cas9的不同其实就是Cas9的不同以及sgRNA设计位点的不同而已。所以你可以按照我们之前查找基因启动子TSS等的文章查找promoter区域，参考设计sgRNA的文章设计sgRNA即可。小编还查阅了诸多文献和资料，赶紧按照下图要求下载吧！

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　　以小鼠GATA4为例：

　　打开UCSC的网站：

　　点击RefSeq Gene中的第一个，绿框所示

　　此处需要吧Promoter/Upstream by选项修改为2000 bases

　　小写字母即为基因上游的启动子区域，出现的第一个大写字母即为外显子（红框所示）

　　接下来利用网站在线设计sgRNA

　　https://crispr.mit.edu

　　由于这个网站只能够输入250bp，而依据文献最优的在-50_-400bp左右，因此需要再向前找。（注：一般情况下sgRNA的最适结合位点需要通过实验摸索）

　　这是根据一个转录本得到的sgRNA，

　　需要检验一下根据这个转录本得到的sgRNA能不能cover住该基因所有的转录本

　　选择以下几个sgRNA：

　　AGCGCAGGCGATCGCTACGC（99）

　　CCATGCGCGCGGAACTCTCG（95）

　　CAGCAAACCGCAAGGACGTC（91）

　　CAGCAAACCGCAAGGACGTC（91）

　　下面我们找的这个是tran variant 1即转录本1，是该基因的另一个转录本。

　　这里利用snapgene把转录本1的启动子区域输入，然后把sgRNA再输入，看看是否能够cover住，结果都可以cover住！所以结果可行！下面就可以愉快的进行实验了！

致谢：本文主要由朱楚洪教授指导、王玉鑫博士汇总整理。另外特别感谢金丹老师、颜瑞清博士的悉心指导，感谢官格队友的热心帮助。助手君在此基础上稍作补充完善。感谢各位群友的无私分享！

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