三代测序之PacBio SMRT技术全解析

气温回升，天气渐暖，

花儿开了一簇又一簇~

在这美好的季节里，

我们准备聊点新话题。

今天小编要来和你分享：

PacBio SMRT测序那些事儿~

测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。

　　PacBio SMRT测序原理

Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：

　　聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部

　　4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部

　　荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光

　　荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基

　　统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列

　　酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落

　　聚合反应持续进行，测序同时持续进行

PacBio SMRT测序原理

PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。

SMRT Cell和ZMWs

将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。

荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸

　　PacBio SMRT测序送样要求

表1 PacBio SMRT测序送样要求

　　PacBio SMRT测序建库流程

DNA打断之后，经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序，建库过程无PCR反应。

PacBio SMRT建库流程

　　PacBio SMRT技术特点

表2 PacBio SMRT技术特点

PacBio SMRT技术有两种测序平台，RSⅡ和Sequel，应该如何选择？小编已将二者的对比表准备好啦~

表3 RSⅡ和Sequel测序平台比较

Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势，Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短。

2016年，安诺基因在三代测序项目中积累了丰富的项目经验，拥有成熟的建库和数据分析流程；2017年，安诺基因将会引入PacBio Sequel测序平台，我们会利用领先的二代及三代测序平台，为大家提供高质量的测序数据，满足广大科研工作者们各类科学研究的需求，一切只为助力科研。

　　文案：建库测序产品线 张静艳

　　设计：胡珊珊