文献解读 |利用环状RNA发表高质量SCI文章的研究思路解析

　　导语

环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。接下来，小编带领大家一起解析一篇高质量的SCI文章，看作者是通过怎样的思路来进行circRNA研究的。

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　　文章来源

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　　背景介绍

环状RNA是一类特殊的非编码RNA分子，在不同的细胞系和物种中已经被发现。在细胞内circRNA同线性RNA比较是非常稳定的，并且在一些研究中circRNA已经被证明是某些特定的miRNA的“海绵”，可以对其进行相应的调控。

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　　解读专栏

本文的研究思路分为四步：首先通过RNA-seq对正常组织样本和肿瘤组织样本分别进行测序，通过数据分析找出了一个差异性高表达的circRNA，来源于基因HIPK3的第二号外显子，命名为circHIPK3；然后运用qPCR和一代测序方法对其高表达量进行了验证，接下来又进行了功能验证和作用机制的研究。

1、通过高通量测序（RNA-seq）找到研究目标

测序的样本分别选了6个不同的正常组织和7个癌组织，经过RNA-seq，总共鉴定出来67358个circRNAs，其中有27296个含有两个以上的反式剪接reads，通过对这些circRNAs进行特征分析发现，大概有80%的circRNAs含有外显子，circRNA的分子长度在500bp左右，d.e.f.图通过聚类和表达丰度的统计说明circRNA在不同组织类型中存在不同的表达趋势。

作者通过进一步分析发现，单个基因可以产生多个circRNAs，一般一个基因可以产生2~6个circRNAs，还有的基因可以产生10个以上的circRNAs，但是同一基因起源的circRNAs可能只有一个是主效表达的，接下来作者以5’CR (circular ratio) > 0.2; 3’CR > 0.2; SRPBM> 1为阈值共筛选到990个高表达的circRNAs，其中circHIPK3显著富集，另外circRNA的表达丰度跟其侧翼内含子的长度相关，高表达的circRNA侧翼内含子序列一般较长，提示侧翼内含子序列和circRNA的环化有一定的关系。

2、对目标circHIPK3的验证和特征分析

接下来作者对选择的目标circHIPK3进行了验证和特征分析。结果显示HIPK3基因可以形成5个环状RNA，其中circHIPK3的表达丰度最高；通过一代测序结果可以发现circHIPK3是由2号外显子单独成环的，并且qPCR结果分析发现，除了肝脏外，在其他五个组织中circHIPK3的表达量远远高于线性mRNA的表达；下图中，c图是用放线菌素D抑制总RNA的合成，检测不同时间点环状和线性mRNA的表达水平，发现环状RNA更加稳定，d图是用RNase R酶对circHIPK3进行处理，通过qPCR检测发现，circHIPK3耐受RNase R酶消化。e图和f图分别用qPCR和原位杂交的方法表明circHIPK3定位于细胞质中。

　　3、目标circHIPK3的功能研究

接着作者对circHIPK3进行了功能研究，经过序列分析发现，HIPK3的2号外显子侧翼序列含有高度反向互补的Alu重复序列，这个序列对于环状RNA的成环很重要，作者将2号外显子和侧翼Alu序列分段构建到真核表达载体中，看侧翼序列对成环是否有影响，结果发现这2个Alu元件对于circHIPK3的形成是必须的，进一步采用CRISPR/Cas9技术，删除293T细胞中circHIPK3侧翼的Alu序列，结果发现删除后环化被抑制，说明侧翼内含子区Alu序列对成环很重要。

另外作者设计了siRNA序列来敲低环状RNA的表达，观察其对细胞功能的影响。si-both可以同时沉默环状和线性RNA，将三类siRNA转染到Huh7、HCT116、Hela细胞，发现干扰环状RNA能显著抑制肿瘤细胞的增殖能力，但是干扰线性HIPK3没有作用，说明沉默环状HIPK3可抑制细胞增殖。

4、目标circHIPK3的机制研究

通过上文的研究得到沉默环状HIPK3可抑制细胞增殖，那么circHIPK3是通过怎样的机制来抑制细胞增殖呢，作者借助公共数据分析发现circHIPK3基因组位置存在许多AGO2结合位点，而AGO2蛋白是miRNA的结合蛋白，提示miRNA可能跟环状RNA结合，作者用荧光素酶报告系统，向293T细胞转染了424个mimic，总共鉴定出9种miRNA荧光素酶活性显著降低，进一步用miRNA靶基因预测软件发现circHIPK3序列存在这9种miRNA的18个结合位点，并进一步通过点突变实验得到circHIPK3可能是这些miRNAs的“海绵”。

接下来，作者将这9个miRNA过表达，发现4个miRNA显著抑制细胞增殖，其中miR-124效果最明显；在Hela细胞中共转染miR-124和circHIPK3，RNA原位杂交实验发现两分子定位相同，暗示两分子有结合；作者又将circHIPK3进行knockdown，发现miR-124靶基因（IL6R和DLX2）的表达下调，将circHIPK3过表达时候，降低了miR-124诱导的增值抑制作用；最后在6个正常组织中进行qPCR检测circHIPK3和miR-124的表达情况，发现在脑中表达最高且两者的表达呈现出正相关，进一步表明了circHIPK3通过直接结合miR-124来抑制其活性。

03 研究小结

1. 无论是正常还是癌症组织，circRNA整体表达丰度较高，且有组织表达特异性；

2. circHIPK3来源于HIPK3的2号外显子，其侧翼内含子Alu重复序列对环状RNA反式剪接成环必不可少；

3. circHIPK3的表达水平显著高于线性HIPK3，通过结合miRNA调节肿瘤细胞的增殖。

　　以上就是文章《Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs》的全部内容啦，若有疑问欢迎随时咨询！我们下期文献详解再见！

　　稿件来源：技术中心李艳艳

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